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    蛋白保存方法详解

    发布时间: 2023-03-07  点击次数: 564次

     生物大分子的贮藏保存可分为干态和液态贮藏两种。蛋白质失活受多种理化因素的影响,主要有空气、温度、水分、光线、酸碱度、样品状态、微生物活动、保存时间和容器等。这些因素可单独起作用,但更多情况是协同作用。总的来说,蛋白质的保存主要考虑其构型稳定、活性中心的保护、避免辅助因子丧失等,以防止其变性、解聚或降解。由于温度和水分对蛋白质的稳定性影响很大,故蛋白质最好是低温、冷冻或冷冻干燥后低温干燥保存。

    1. 液态保存

      (1).在低温下保存 蛋白质对热敏感,温度越高,稳定性越差。因此,低温保存蛋白质溶液在绝大多数情况下是有利的。一般蛋白质越纯,其稳定性越差。特别是纯酶溶液,对热很不稳定(少数酶例外,如核糖酸酶能短期煮沸,胰蛋白酶能在稀HCl中耐90℃,及某些高温细菌产生的耐热性酶等),多数在35℃一40℃以上就会失活,难以长期保存,在普通冰箱中通常也只能保存一周左右。因此,液态蛋白质样品常常在—5℃~—10℃以至—20℃以下冰冻保存比较理想,有时经数月或数年仍保留大部分活性。

      但是,各种蛋白质的耐热性不同,并非温度越低.稳定性越好。羧肽酶、脂蛋白和某些抗体经冰冻再融解,即wan全变性破坏。但某些酶经冻融后,活性反而增加,这可能是由于酶颗粒结构松散,表面积增大,暴露出更多活性基团的缘故。反复冰冻和融化一船会导致蛋白质变性.应尽量避免。为了防止冻融损伤,冰冻保存要求样品浓度大、体积小、表面积大、含盐低、冻结迅速、—70℃以下保存、用时迅速融化等。

       (2).在稳定PH下保存 多数蛋白质只有在很狭窄的pH范围内才稳定.超出此范围即迅速变性。如鲸肌红蛋白在等电点PH6.8附近时稳定,卵类粘蛋白在中、酸性条件下对热 稳定。蛋白质稳定存在的PH一般是等电点。因此,酸性、中性和碱性蛋白酶酌稳定pH分别为PH2~PH6、PH6~PH9和PH5~PH10.5。但也有例外,如血浆蛋白质的等电点PH4.6,而其稳定pH为6.8,稳定PH与其等电点并不相同。酶的最wen定PH也并非是酶反应的最适PH,二者有时可相差l至数个pH单位。所以保存液态蛋白质样品时,应小心调到其稳定PH范围内。

      (3).在高浓度下保存 液态蛋白质易受水化作用影响,保存时浓度不能太稀(如1毫克/毫升以下),否则将可能引起亚基解离、表面变性或器壁吸咐。一般蛋白质在浓溶液中比较稳定,中间样品的保存可采用湿法沉淀。需要保存酶溶液时,其蛋白质浓度也应大于1%。保存时间较长时,还需加入防腐剂、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)或其它稳定剂。如免疫球蛋白可加 0.04%叠氮钠,-20℃下冻存。蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的选择:中性蛋白酶常用EDTA,碱性蛋白酶用二异丙基氟磷酸(DFP)、苯甲基璜酰氟(PMSF),酸性蛋白酶用十二烷基磺酸钠(SDS)、N —溴琥珀酰亚胺。活性中心为丝氨酸的蛋白面加二异丙基氟磷酸,活性中心为巯基的蛋白酶加对氯汞苯甲酸等。但某些抑制剂(如DFP、PMSF)不仅抑制蛋白酶,对其它酶可能也有抑制作用,使用时应慎重。

      (4).在保护剂存在下保存 很早就有人观察到,在无菌条件下,室温保存了四十五年的血液,血红蛋白仅有少量改变,许多酶仍保留部分活性。另一方面,有些纯酶浓即使冷却也很不稳定,保存期仅为几小时或几天。上述两种现象的原因是血液中含有某些使蛋白质稳定的因家,而纯酶则缺乏这些稳定因素。为了较长期保存蛋白质溶液(特别是敏感的纯酶 或稀蛋白溶液),常常加入某些稳定剂进行保护。多数蛋白质只有在疏水环境才能长期保存。加入某些物质可以降低溶液的极性,避免蛋白质变性失活。一些蛋白质在高离子强度(1mol/L~4mol/L或饱和盐液)的极性环境下保持活性,中性盐可稳定这类蛋白质。 一些蛋白质表面或内部含有半胱氨酸巯基,易被空气中的氧缓慢氧化为次磺酸或二硫化物,使蛋白质因电荷或(和)形状发生改变而失活。保存时可加人巯基试剂,使蛋白质处于还原状态,并隔绝空气(甚至真空或惰气中)密闭保存。

      2.固态保存

      (1).制成干粉或结晶 固态蛋白质比液态稳定。一般蛋白质含水量超过10%时,无论在室温或低温均容易失活;含水量若降低至5%时.在室温或冰箱中均比较稳定,但在37℃活性则明显下降。低含水量对微生物和化学活性不利,一般认为,微生物活性在含水量10%以下、化学活性在3%以下即被抑制。长期保存蛋白质的最好办法是把它们制成结晶或干粉(现多采用冷冻干燥)。

      (2).制成水不溶酶 在多数情况下,酶经固定化后,对酸、碱、蛋白酶、温度等稳定性提高,更易于保存。

      (3).制成酶衍生物 这也能提高某些酶的稳定性。 总的来说,蛋白质的保存主要考虑其构型稳定、活性中心的保护、避免辅助因子丧失等,以防止其变性、解聚或降解。由于温度和水分对蛋白质的稳定性影响很大,故蛋白质最好是低温、冷冻或冷冻干燥后低温干燥保存。

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