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    原代细胞培养、传代、冻存、复苏、分离、鉴定

    发布时间: 2022-11-25  点击次数: 484次

      原代细胞培养技术


      一、组织块直接培养法

      1、取材,用 Hank's 液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
      2、用手术剪将组织剪切成 1 mm3 左右的小块,再用 Hank's 液洗三次。
      3、将组织块转移至培养瓶,并贴附于瓶底面。
      4、轻轻将培养瓶翻转,瓶底朝上,向瓶内注入适量的培养液,将培养瓶放置在 37 ℃ 恒温箱内培养。
      5、放置待组织小块贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37 ℃ 继续培养。


      二、消化培养法

      1、取材,用 Hank's 液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
      2、用手术剪将组织剪切成 1 mm3 左右的小块,再用 Hank's 液洗三次。
      3、视组织块量加入酶液,37 ℃ 中消化 20~40 分钟,每隔 5 分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
      4、加入 3~5 mL 培养液以终止酶消化作用(或加入相关酶抑制剂)。
      5、静置 5~10 分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。
      6、1,000 rpm,离心 10 分钟,弃上清液。
      7、加入 Hank's 液 5 mL,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
      8、加入培养液 1~2 mL(视细胞量),血球计数板计数。
      9、将细胞转移到培养瓶中,37 ℃ 下培养。


      三、 器官培养

      1、将不锈网做成支架形状,调整其高度至培养皿的 1/2 深度平面,在其表面放置 0.5 μm 孔径滤膜。
      2、将培养液加入培养皿中,使液面刚刚接触到滤膜,但不要使其浮起。
      3、将要培养器官组织放在滤膜上,一般厚度不要超过 200 μm,水平面积不超过 10 mm2
      4、将上述准备好的培养物放入 CO2 培养箱,并加注氧气调整氧分压,最好到 90%。
      5、培养过程中要注意观察培养液平面,尽可能保持在与滤膜一致的水平上。
      6、上述可进行器官培养 1~3 周,每 2~3 天换液一次,并根据情况做进一步实验和检测。

       

      原代细胞传代技术


      一、贴壁细胞的消化法传代

      1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。
      2、加入 1 mL 左右消化液(胰蛋白酶或与 EDTA 混合液)轻轻摇动培养瓶,使瓶底细胞都浸入溶液中。
      3、消化 2~5 分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察,发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时,弃去消化液,加入培养液终止消化。
      4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分别接种到另外两到三个培养瓶中,置 37 ℃ 培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。


      二、悬浮细胞的传代

      1、直接传代
      ① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后,将上清吸掉 1/2~2/3。
      ② 用吸管吹打形成细胞悬液后,分别接种到另外两到三个培养瓶中,置 37 ℃ 培养箱中培养。

      2、离心法传代
      ① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内,离心 800-1,000 rpm,5 分钟。
      ② 去除上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打使之形成细胞悬液。
      ③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中,置 37 ℃ 培养箱中培养。

       

      原代细胞冻存技术


      1、选用生长情况好,数量较多的原代细胞,冻存前一天换液一次。
      2、贴壁细胞需用 0.25% 胰酶常规消化将细胞消化下来,将细胞悬液收集至离心管中。
      3、1,000 rpm 离心 5 分钟,弃上清液。
      4、沉淀加含 DMSO 的培养液,计数,调整至(1-10)×106/mL。
      5、将悬液分至冻存管中,每管 1 mL。
      6、密封冻存管,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
      7、用记号笔标明细胞种类,冻存日期。
      8、按下列顺序降温:室温→4 ℃(20 分钟〕→冰箱冷冻室(30 分钟)→超低温冰箱(-80 ℃ 过夜)→液氮。

       

      原代细胞复苏技术


      1、取出细胞,迅速放入 37 ℃ 温水中快速解冻。
      2、吸出细胞悬液,并加 10 倍以上培养液。
      3、1,000 r/分钟离心 5 分钟,去除上清。
      4、用培养液适当稀释后接种培养瓶,放入 37 ℃ CO2 培养箱静置培养。
      5、镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液,继续培养。

       

      原代细胞鉴定技术


      一、形态学鉴定

      1、在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征
      2、细胞染色检查 :
      a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中,加细胞悬液后培养;
      b) 待细胞长满玻片后取出,用 PBS 清洗,之后放于载玻片上,待其自然干燥;
      c) 用 PBS/甲醇(1:1)固定 15 分钟;
      d) 弃固定液,加合适的染色液染色;
      e) 染色完毕后用清水洗净,置于空气中干燥,
      f) 干燥后,用二甲本透明,光学树脂封片后观察。


      二、免疫组织细胞化学鉴定

      1、将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中,将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片;
      2、PBS  清洗标本 3 次,各 1 分钟;
      3、4% 多聚甲醛固定 15 分钟;
      4、置于空气中干燥;
      5、PBS 清洗标本 3 次,各 2 分钟;
      6、0.5% Triton X-100  孵育 1 次 20 分钟;
      7、PBS 清洗标本 3 次,各 2 分钟;
      8、3% H2O2  孵育 15 分钟;
      9、DPBS  清洗标本 3 次,各 2 分钟;
      10、封闭血清孵育(5%  正常二抗血清 DPBS 液 20 分钟)
      11、一抗孵育,4 ℃ 过夜或 37 ℃ 60 分钟;
      12、PBS 清洗标本 3 次,各 5 分钟;
      13、二抗工作液孵育(湿盒)37 ℃ 30 分钟;
      14、PBS 清洗标本 3 次,各 5 分钟;
      15、C 液(湿盒)37 ℃ 30 分钟;
      16、PBS 清洗标本 3 次,各 5 分钟;
      17、用显色液进行显色;
      18、蒸馏水洗涤 2 次 1 分钟;
      19、苏木素复染 1 分钟;
      20、清水洗涤 30 分钟;
      21、光学树脂封片后观察。

       

      原代细胞分离技术


      取人或动物体内(或胚胎)的组织,将其剪碎至 1 mm3 的组织块,再采用的如下方法进行分离培养:
       

      一、悬浮细胞的分离方法


      1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中,1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。
      2、去掉上清,离心沉淀用无钙、镁的 PBS 清洗后  1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。此步重复两次。
      3、用培养基重悬,调整适当细胞浓度后分瓶培养。
      4、如选用悬液中某种细胞,可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。


      二、实体组织材料的分离方法
       

      (一)机械分散法


      1、纤维成分很少的脑组织,部分胚胎组织,用剪刀剪碎至 1 mm3 的组织块。
      2、用 PBS 清洗两次后
      ①用吸管吹打,分散组织细胞。
      ②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出。
      ③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。
      3、收集细胞转入离心管中,1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。
      4、去上清,加入含血清的培养基,重悬后移至培养瓶中培养。

       

      (二)消化分离法


      1、酶消化分离法(过夜冷消化法)
      ①细胞间质较少的软组织,如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等,用 Hanks 液清洗组织三次,剪成碎块大小为 4 毫米左右。
      ②再用 Hanks 液洗 2~3 次以除去血球和脂肪组织。
      ③加入 0.25% 的胰蛋白酶,摇匀后放 4 ℃ 过夜。
      ④次日再用 Hanks 液洗涤,弃去上清,共洗 2~3 次。
      ⑤加入少量含血清的培养基吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。

      2、非酶消化法(EDTA  消化法)
      ①把组织块剪碎,呈 1 mm3 大小的组织块。
      ②将碎组织块在平皿中用无钙镁 PBS 洗 2~3 次。
      ③加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA)于 37 ℃ 水浴中作用适当时间(中间可轻摇 1~2 次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。
      ④弃去上清,加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应,并洗涤 2~3 次后,加入wan全培养基。
      ⑤用吸管吹打,使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。

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