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    细胞传代操作步骤

    发布时间: 2022-11-16  点击次数: 215次

    一、   贴壁细胞传代(以一个T25瓶为例)

    1、 吸出原培养液;

    2、 加入2ml左右PBS,轻轻晃动培养瓶润洗细胞,吸出PBS丢弃;

    3、 加入1ml左右胰酶,轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞,放入培养箱消化;

    4、 消化时间跟据细胞特性有所不同,显微镜下看到细胞块中间的细胞明显分离变圆,侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化,全程不要拍打培养瓶;

    5、 加入3ml含血清的培养基终止消化,吹打细胞使之脱落并在液体里反复吹打使细胞,使之尽量呈单颗细胞的悬浮液,这时可以在显微镜看下;

    6、 收集细胞悬液离心,1200rpm(约250g) 3分钟,离心完吸出上清丢弃。

    7、 加入新鲜培养基,吹打几下混匀细胞即可,按需接种到新培养瓶,补足培养基,拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养。

    8、 检查培养箱二氧化碳,温度和水盘。

     

    二、   悬浮细胞传代(以一个T25瓶为例)

    1、 轻轻吹散悬浮细胞,部分贴壁松散的悬浮细胞可直接吹打培养瓶底部使细胞悬浮,收集细胞悬液到无菌离心管中,离心1200rpm(约250g) 3分钟,离心完毕吸出上清丢弃;

    2、 加入适量新鲜培养基重悬细胞,按比例接种至培养瓶(接种比例按实际情况,不确定可计数后再接种);

    3、 常规细胞推荐以3~5×105cells/ml传代,长到2×106cells/ml传出;

    4、 建议刚开始几代计数后传代,后面可以根据经验按比例传代。

     

    三、     半贴壁半悬浮细胞传代(以一个T25瓶为例)

    1、 培养液(含悬浮的细胞):用移液器吸出培养液转移到无菌离心管中;

    2、 贴壁部分:用1ml PBS洗细胞,吸出PBS放入到第1步装有培养液的离心管中收集(不要直接丢弃,里面有细胞);

    3、 培养瓶加入胰酶1ml,放入培养箱静置消化;

    4、 消化时间跟据细胞特性有所不同,显微镜下看到细胞明显收缩变圆,侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化,全程不要拍打培养瓶;

    5、 用3ml含血清的培养基终止消化,将消化下来的细胞悬液吹散细胞后收集到第1步的离心管;

    6、 将离心管在1200rpm(约250g) 3min离心,离心完毕弃掉上清,加入新的培养基重悬,按实际情况分瓶,放入培养箱培养。

     

    温馨提示:

    1、 每丢弃一个液体前都要想一下里面有没有可能有细胞,避免丢失细胞。

    2、 细胞种类、细胞密度、细胞状态、甚至胰酶的品牌,均影响到细胞的消化时间,所以消化的时候不要只看时间,以显微镜下细胞的状态来确定消化终点,部分难消化的细胞消化时间甚至可以长达15分钟。

    3、 细胞的传代比例通常说的是等体积的容器,不同容器需要换算;例如:一个T25培养瓶的细胞传到一个10cm培养皿里面,虽然是1传1,但是比例可不是1:1;T25瓶底面积25cm2,10cm培养皿底面积约为55cm²(10cm的培养皿指的是培养皿的外径,而培养皿的内径约为8.4cm,故根据内径可求出其底面积为55cm²),所以实际传代比例为1:2.2。

    4、 在有关离心机的实验中,标准的离心条件应该是用RCF(relative centnifugal fieldt)来衡量,而在实际大家实验过程中,往往习惯用rmp即每分钟转速来表示;RCF即表示相对离心场,以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍数来表示;RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r(其中r表示离心机转轴中心与离心管中心的距离,单位为cm);所以每个实验室离心机转速设置是不一样的,常规建议1200rpm 大约250g。


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